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Plataforma de Reprogramación y diferenciación celular

La Plataforma de Reprogramación y Diferenciación Celular está situada dentro de las instalaciones de la Fundación Inbiomed y fue creada a mediados del 2010.

El objetivo general de la Plataforma de Reprogramación y Diferenciación Celular es facilitar y optimizar tanto la producción de líneas pluripotentes humanas derivadas de pacientes con diversas patologías, utilizando tanto metodologías integrativas como no integrativas, como la obtención de linajes determinados utilizando protocolos de diferenciación inducida.

En nuestra plataforma ofrecemos tanto un servicio interno, prestando especial atención a las necesidades de los investigadores de Inbiomed y entidades colaboradoras, así como un servicio externo.

Las células madre pluripotentes inducidas (induced pluripotent stem cells, células iPS) son células somáticas adultas reprogramadas hacia un estadio pluripotente similar al de las células madre embrionarias (embryonic stem cells, ESC). Este descubrimiento ha generado gran expectativa dado el potencial de estas células en la comprensión y tratamiento de un amplio rango de enfermedades y ha aumentado, asimismo, el interés por los mecanismos implicados en la reprogramación del núcleo celular.

La manera más directa de inducir pluripotencia es mediante la transducción de células somáticas con factores de transcripción capaces de producir la reprogramación del núcleo celular. En el trabajo pionero de Takahashi y Yamanaka (2006), se identificaron cuatro factores que eran suficientes para inducir pluripotencia en fibroblastos: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (OSKM).

Infección con vectores lentivirales o retrovirales

Disponemos de cuatro vectores retrovirales (pMXs) y lentivirales bicistrónicos. Éstos últimos co-expresan cada uno de los factores OSKM junto con una proteína fluorescente bajo el promotor de la fosfoglicerato-quinasa humana (hPGK). La combinación de proteínas fluorescentes permite un seguimiento en tiempo real de la expresión de cada factor mediante microscopía de fluorescencia.

Representación esquemática de los vectores vexGFP-OCT4; mCitrine-SOX2; mCherry-KLF4 y mCerulean-cMYC. LTR, Long Terminal Repeat

Infección con virus Sendai (SeV) usando el Cyto Tune™-iPS Reprogramming Kit

Uno de los métodos no integrativos más prometedores se basa en la utilización del virus Sendai. El sistema provisto por el Cyto Tune –iPS Reprogramming System se basa en la utilización de SeV replicación-incompetente para la expresión efectiva de los factores de reprogramación en células somáticas. El kit utiliza virus que son no-integrativos y permanecen en el citoplasma.

Representación esquemática de los ciclos de vida de los SeV no integrativos (izq) y de otros vectores virales integrativos (der). Figura modificada de la guía de usuario CytoTuneTM-iPS Reprogramming Kit

Metodología

Las células somáticas humanas se infectan durante aproximadamente 16 horas con concentrados virales (sean lentivirus, retrovirus o virus Sendai) que contienen los cuatro vectores OSKM. 1 a 7 días después de la infección, las células se plaquean sobre un sostén celular de fibroblastos humanos irradiados (HFF) con medio de cultivo específico para ESC humanas, que se cambiará cada 48 horas. Aproximadamente 15-25 días después, se pueden observar colonias con una morfología similar a ESC que se pasarán cada una de ellas manualmente a placas con soportes celulares de HFF. Tras ser expandidas se caracterizan mediante detección de marcadores de pluripotencia y capacidad de diferenciación.

Representación esquemática de la metodología para la generación de iPSCs

El investigador solicitante debe estar informado de que una vez generadas y comprobado el estado pluripotente, las células iPS deben ser depositadas en el Banco Nacional de Líneas Celulares (BNLC) en virtud de la Ley 14/2007 de Investigación Biomédica. Inbiomed cuenta con Inbiobank, nuestro biobanco nodo del BNLC, por medio del cual pueden realizarse la solicitud de depósito.

Resumen de los servicios externos:

Módulo 1: derivación de fibroblastos a partir de biopsia de piel.

Este servicio toma aproximadamente un mes.

  • El aislamiento y expansión de fibroplastos se realizará de acuerdo con los procedimientos operativos estándar establecidos en Inbiobank.
  • Sólo se aceptarán biopsias de piel frescas.
  • Los investigadores deberán proporcionar el test de patógenos virales correspondiente.

Módulo 2: reprogramación de fibroblastos utilizando vectores integrativos o no integrativos.

Este servicio puede tomar hasta 6 meses, incluye:

  • Expansión de los fibroblastos, test de micoplasma, congelación de viales en primeros pases y plaqueo para la infección viral.
  • Infección en pocillo de 35 mm (75-100 x103/ pocillo) con los vectores virales. En el caso de utilizar métodos integrativos, los sobrenadantes y concentrados virales serán producidos por la Plataforma de Vectores Virales de Inbiomed.
  • A los 5-7 días, se chequea la expresión de los proteínas virales por microscopía de fluorescencia y se pasan 50x103 células a 2 placas de 10 cm con sostén celular de fibroblastos irradiados (un pocillo sin compuestos, uno con VPA).
  • Cosecha manual de las colonias (30-40 días post-infección).
  • Expansión de las colonias.
  • Control de micoplasma.
  • Criopreservación de los viales (hasta 10 crioviales por línea).

Los fibroblastos a reprogramar deben estar en un pase bajo (pase <5) y en fase exponencial de crecimiento. Si la morfología celular no es adecuada o las células no proliferan, se discutirá con el IP solicitante si fuera conveniente obtener nuevas muestras o seguir adelante con la infección. La proliferación de los fibroblastos podrá ser testada mediante análisis del ciclo celular por citometría de flujo.

En algunos casos, si bien pueden obtenerse agrupaciones de células granulares (colonias no iPS), no se obtienen colonias iPS en el primer intento de reprogramación. En este caso pueden utilizarse otras estrategias (pequeñas moléculas, cambios en las condiciones de infección y siembra sobre sostén celular, etc.). Si el segundo intento no es exitoso a los 40 días post-infección, no se continuará con el proceso. Una vez comprobada la expresión de los transcritos virales, el fracaso en el proceso de reprogramación puede ser debido a razones propias de las células utilizadas. Esto puede deberse a que la reprogramación celular es un proceso estocástico y ocurre con una frecuencia muy baja (0.001-0.1%), determinada por una gran variedad de factores tales como tipo celular, edad del donante, número de pases, métodos de extracción y preservación de la muestra, etc.

En función del número de colonias generado por muestra, recogeremos manualmente 3-10 colonias. Sin embargo el IP debe considerar que algunas muestras pueden producir menos de 3 colonias. Se comprobará que las colonias hayan silenciado los transcritos virales por microscopía de fluorescencia y qRT-PCR. Las células iPS generadas se enviarán al IP solicitante o bien en cultivo o bien congeladas. En este último caso, se enviarán 5 crioviales de cada línea de iPS.

Asimismo, la plataforma está implementando la reprogramación de otros tipos celulares tales como células CD133+ derivadas de cordón umbilical y linfocitos T, que ha resultado ser exitosa utilizando el virus Sendai.

Módulo 3: caracterización básica: marcadores de pluripotencia y de diferenciación in vitro.

Este servicio toma aproximadamente 1 mes. Incluye:

  • Ensayo de fosfatasa alcalina.
  • qRT-PCR para dos marcadores de pluripotencia.
  • Formación de EBs, qRT-PCR para 2 marcadores de mesodermo, 2 marcadores de endodermo y 2 marcadores de ectodermo.

Módulo 4: formación de teratomas.

Este servicio toma 3 meses y será llevado a cabo en la Plataforma de Modelos Animales de Inbiomed, incluye:

  • Expansión de las células iPS.
  • Recolección de las células y transporte a la Plataforma de Modelos Animales de Inbiomed.
  • Inyección subcutánea de las células (1 ratón NOD/SCID por línea de iPS).
  • Técnica histológica.
  • Análisis.

Módulo 5: cariotipo.

Este servicio toma aproximadamente 1 mes y será llevado a cabo en el servicio de Genética de la Policlínica Gipuzkoa, incluye:

  • Expansión de las colonias iPS en flasks T25.
  • Control de micoplasma.
  • Tratamiento a corto plazo con colchicina para detención de las células en metafase y traslado al servicio de Citogenética de la Policlínica Gipuzkoa.

Módulo 6: fingerprinting.

Este servicio toma aproximadamente 1 mes. Incluye:

  • Extracción de ADN genómico de la muestra inicial de fibroblastos.
  • Cultivo y expansión de células iPS en condiciones libres sostén celular y extracción de ADN genómico.
  • Análisis de los polimorfismos de repeticiones cortas en tándem (STRPs-Short Tandem Repeat Polymorphisms).

Inversión cofinanciada por el Ministerio de Ciencia e Innovación

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